主题：新冠肺炎诊断标准（第一版1.16前）的逻辑困境 -- 惊蛰

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【关于从患者血清中直接扩增 2019-nCoV 序列的思考】

两由之 2020-02-12

由于 2019-nCoV 核酸定量 PCR 出现高达 55%左右的假阴性 国家卫健委对于这次武 汉新冠肺炎的诊断标准进行了第六次改版，肺部的改变和发热作为新冠肺炎的主要诊 断标准，把定量 RT-PCR 的结果只作为参考标准。为什么定量 RT-PCR 出现如此多的 假阴性?如何提高 2019-nCoV 序列的检出率?这是必须要面对的两个主要问题。在抗 疫的初期，由于过度依赖 RT-PCR，放过了大量的隐形感染者，不得不说，后续的大 爆发和这个老百姓说的核酸诊断过多的假阴性有关。

定量 RT-PCR 的结果假阴性的原因是多方面的:

1. 取样的类型部位和时间点:一般而言，肺泡灌洗液效果最好，然而操作复 杂，需要富集病毒;鼻拭子/咽拭子是最常用的方法，但如果病毒负荷低， 很难得到阳性结果;

2. 样品 RNA 提取操作过程中病毒颗粒丢失:如果样品里仅仅只有几个拷贝的 病毒，高损失率的 RNA 提取方法会大大地丢失病毒颗粒;

3. 反转录的效率低下;

4. 扩增的循环数不够;

5. PCR 长度/引物设计/引物的特异性。

如果直接用肺泡灌洗液/鼻拭子/咽拭子进行 PCR, 由于有大量的粘液，分泌物，不适 合用于直接 PCR.

在武汉新冠肺炎爆发初期，报道说每天只能筛查 200 多病人，而今估计检查 2000 病 人没有问题，但这个检查的作用已经渐渐推到次要地位。如何提高核酸检查的阳性 率，是摆在我们科研人员面前的当务之急。

【病毒 PCR 扩增区】

经过仔细研究，比较，我挑选了 4 段 2019-nCoV 的核酸序列作为 PCR 的靶序列，这 四个片段长度都在 200bp 以内，位于病毒的 Spike 蛋白区，与其他冠状病毒/细菌/人 体基因组无交叉，建议设计新的引物和探针，optimize 后，用于一线检测。这四段序 列如下:

片段一 (Spike 区):

GACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTA 23646 CACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAAT 23689

片段二(Spike 区): GCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATA 21645 CACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTT 21705 ACATTCAACTCAGGACTTG 21724

片段三(Spike 区): CACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTG 22240 GTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA 22300 AGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAG 22331

片段四(Spike 区): TCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGG 23661 TGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTAT 23721 TAGTGTTAC 23730

【关于从患者血清采样】

WHO 的资料表明，MERS 冠状病毒感染，早期就在血清样品中扩增到病毒片段;很多 文献研究发现，猫感染猫科冠状病毒后，血清里也可以用 PCR 扩增出病毒片段。同样， 其它病毒感染，如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染患者血清，也 可以在早期查出病毒。2003-2004 的 SARS 爆发，也有采集血清做 PCR 的报道。

越来越多的证据表明，武汉新冠肺炎的病人，在感染的早期，就经历了病毒血症，在后 期病毒血症引起多器官功能损害，病毒性心肌炎更是常见并发症和死亡原因之一。病毒 感染呼吸道上皮后，大量病毒复制，很快进入血液。因而，采集血样做病毒核酸 PCR， 可以极大限度减少医护人员的工作量，减少因为操作而传染的危险性。

血样采集后，放到 1.5 毫升 Eppendorf 管，离心后取血清，直接进入 RT-PCR. 余下的 血清备用，或用于抗 2019-nCoV IgM 检测。

【关于直接进行反转录 PCR】

由于本人不是从事病毒学研究，手上没有实际病毒操作数据。我只能根据以往直接的经验，草 拟一步法反转录 PCR。

1. 制备一步法 RT-PCR 反应混合物 (包含 1μl 反转录酶，1μl 100nmol 上游引物和下游 引物，1μl 0.1M DTT, 4μl 5X RT Buffer, 1μl RNase out, 10μl Heat-start Taq-SyberGreen reaction mixture (containing Taq/dNTP/PCR buffer and MgCl);

2. 加入患者血清 2ul, 混合均匀;

3. 反应步骤如下:

A. 25°C5min;50°C40min,95°C10min B. 95°C8s,57°C4s,72°C6s,40cycles. C. Meltingcurvefrom65°Cto95°C.

4. 分析PCR结果，如果溶解曲线正常，CT值33.3定义为一个拷贝，30为十个拷贝， 26.66 为 100 拷贝，余此类推。